Thorlabs技术文章—荧光显微镜滤光片教程

▍荧光显微镜滤光片

▍荧光团

荧光团是能够产生荧光的分子或分子的一部分。使用适当频率的光照射时，荧光分子会从基态变成激发态。但是，处于激发态的分子是不稳定的。在很短的时间(一般是fs到ns级)就会释放一个光子，使分子回到较低的能态。发射光的波长相比激发光的波长更长(能量更低)，因为振动、声子和热能等机制会损耗一部分能量。

除非被光漂白破坏——荧光团因光致化学损伤或共价键改变引起的不可逆破坏，单个荧光团能连续被激发。一个特定的荧光团在光漂白之前的平均激发和发射周期数取决于它的分子结构和局部环境；有些荧光团仅能发射几个光子就迅速漂白，而有些荧光团要稳健得多，能够经历数千次甚至上百万次周期才发生光漂白。

▍荧光显微镜滤光片

荧光显微镜光路示意图

上图的实验装置显示了落射荧光显微镜中使用的典型滤光片，这种显微镜的激发光和发射光都会通过显微物镜。对于特定应用，精心选择合适的滤光片和反射镜，能最大程度地提高信噪比。如原理图所示，使用三种滤光片来增强荧光信号，同时滤除不需要的光。

▍激发滤光片

激发滤光片只允许荧光激发波长峰值附近的窄带波长通过。比如在下图中，黄色荧光蛋白(YFP)激发滤光片(MF469-16)透过率大于90%的通带是489到505 nm；通带之外的入射光被部分阻挡(透射区域附近)，或者被完全阻挡(远离带通波段)。

▍二向色镜

二向色镜用来反射波长小于截止波长的光，透过所有其它的波长。在显微镜中，二向色镜将规定波长范围的光引导至样品和图像平面。二向色镜的截止波长是指透过率等于50%的波长。比如在下图中，黄色荧光蛋白(YFP)二向色镜(MD515)的截止波长约为515 nm。规格标签提供了每种二向色镜反射率和透过率≥90%的波长范围。

MDF-YFP滤光片组透过率曲线图。注意，二向色镜(绿色)反射激发波长范围内的光(蓝色)，透过发射波长范围内的光(红色)。

将一片二向色镜相对入射光成45°放在实验装置中，激发光(如上图中蓝线所示)在二向色镜的表面反射，然后通过物镜入射到样品上，而样品发射的荧光(如上图中红线所示)通过二向色镜，进入探测系统。

虽然二向色镜在荧光显微镜中起着至关重要的作用，但在阻挡不必要的光束时还不够理想；通常情况下，波长小于截止波长的光有大约90%被二向色镜反射，而波长大于这个值的光大约有90%透射。因此，部分激发光会和荧光一起透过二向色镜。为了阻止这种不必要的光到达探测系统，除了二向色镜还需要使用发射滤光片。

▍发射滤光片

发射滤光片能让样品产生的荧光到达探测系统，同时截止不必要的激发光。与激发滤光片类似，发射滤光片只允许荧光发射波长峰值附近的窄带波长通过。比如在上图中，黄色荧光蛋白(YFP)发射滤光片(MF535-22)透过率大于90%的通带是524到546 nm；通带之外的入射光被部分阻挡(透射区域附近)，或者被完全阻挡(远离带通波段)。